AUTOR: Sanzio Silva Santana
ORIENTADORA: Marilda de Souza Gonçalves
TÍTULO DA TESE: EFEITOS DO HEME E PROPRIEDADES TERAPÊUTICAS DA HIDROXIUREIA DA ANEMIA FALCIFORME
PROGRAMA:  Pós-Graduação em Patologia Humana (UFBA/FIOCRUZ)
DATA DE DEFESA: 13/09/2018

RESUMO

INTRODUÇÃO: a fisiopatologia da anemia falciforme (AF) é marcada por crises hemolíticas e vasoclusivas intermitentes com aumento da condição redox no microambiente vascular que favorece a cronicidade inflamatória.

OBJETIVOS: avaliar os efeitos do heme em marcadores clínicos-laboratoriais de pacientes com AF; o papel de hemácias falciformes íntegras e lisadas na ativação do inflamassoma NLRP3, e se o tratamento de pacientes com HU interfere na ativação do inflamassoma NLRP3; e investigar as propriedades antioxidantes da HU.

MÉTODOS: para o manuscrito 1, amostras de sangue de pacientes com AF (n = 80) foram coletadas durante uma consulta clínica regular, e a história médica de cada paciente foi obtida a partir dos prontuários. Foram realizadas análises hematológicas, bioquímicas, perfil de hemoglobinas, determinação dos haplótipos ligados ao grupo de genes da globina beta. A dosagem do heme foi realizada por ELISA. Em seguida, foi investigada a associação dos níveis plasmáticos do heme com marcadores clínicos e laboratoriais. Para o manuscrito 2, essas análises foram realizadas em pacientes em estado estável incluindo pacientes tratados (n = 29) e não tratados (n = 108) com hidroxiureia (HU). Voluntários sadios (n = 30) foram utilizados como controle. PBMC de voluntários sadios foram desafiados com hemácias falciformes íntegras e lisadas (n = 8) e hemácias normais (n = 10). A expressão gênica de componentes do inflamassoma NLRP3 (NRLP3, IL1β, CASP1 e IL18) foi realizada por RT-qPCR a partir do RNA de leucócitos obtidos do sangue total de pacientes tratados (n = 13) e não tratados com HU (n = 15), e voluntários sadios (n = 20). Dosagens de IL-1β e LTB4 foram realizadas por ELISA. No manuscrito 3, ensaios de inibição de DPPH foram realizados para determinar a atividade antioxidante da HU. HUVEC e PBMC foram tratados com HU, na presença ou ausência de hemina, para avaliação da citotoxicidade, inibição de ânions superóxido, produção de nitrato/nitrito e expressão de enzimas antioxidantes por RT-qPCR (SOD1, GPx, GSR e HMOX1). Análises de microarranjo foram realizadas em HUVEC desafiadas com HU.

RESULTADOS: o aumento no heme livre está associado com o aumento de hemoglobina S (HbS), contagem de monócitos, marcadores hepáticos [bilirrubina total e frações, aspartato transaminase (AST)], triglicérides e lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL-C); e inversamente associado com os níveis de hemoglobina fetal (HbF) e lipoproteína de alta densidade (HDL-C). O genótipo BEN/BEN confere níveis mais elevados de HbF aos pacientes com AF, e CAR/CAR níveis mais baixos. Os haplótipos não apresentaram associação com liberação de heme livre. Níveis aumentados dessa molécula estão associados com histórico clínico de AVC na AF. No manuscrito 2, hemácias falciformes (SS-RBC) íntegras e lisadas induziram a expressão de NLRP3, CASP1 e IL1B e IL18 em PBMC. Curiosamente, SS-RBC íntegras induziram níveis mais elevados de expressão de IL1B em comparação com SS-RBC lisadas. SS-RBC íntegras e lisadas induziram níveis elevados de IL-1β, diferentemente de AA-RBC. Além disso, AA-RBC e SS-RBC induziram a produção de LTB4, embora seus níveis tenham sido mais pronunciados em PBMC desafiados com SS-RBC íntegras. Pacientes com AF apresentaram níveis séricos mais elevados de heme livre e proteína C-reativa (C-RP) em comparação com o grupo de voluntários sadios. Indivíduos tratados com HU apresentam níveis reduzidos de heme livre e níveis aumentados de PCR. Níveis elevados de ferritina foram observados em indivíduos com AF independente do tratamento com HU. Pacientes com haplótipo CAR/CAR apresentaram aumento nos níveis de HbF. Uma diminuição significativa na expressão de NLRP3 foi observada em indivíduos com AF tratados com HU, embora essa redução não tenha sido significativa para CASP1, IL1B e IL18. Indivíduos tratados com HU apresentaram níveis séricos elevados de IL-1β e diminuição na produção de LTB4 em relação ao grupo não tratado. No manuscrito 3, a HU apresentou atividades antioxidantes inibitórias apreciáveis (similar ao controle BHT) em concentrações equivalentes à encontrada no plasma de pacientes que tomam a droga (~200 μM). Os tratamentos com HU ou HU+hemina, não induziram toxicidade em PBMC e HUVEC. A HU não diminuiu o acumulo de O2•– em PBMC na presença ou ausência de hemina. O tratamento HU+hemina estimulou a produção de nitrato/nitrito em PBMC e HUVEC. A HU aumenta a expressão de SOD1 e GPx em PBMC e HUVEC. O aumento na expressão de GSR é observado em PBMC e HUVEC submetidas ao tratamento combinado de HU com a hemina. HU não induz a expressão de HMOX1 e não diminui a sua expressão em combinação com a hemina tanto em PBMC quanto em HUVEC. O ensaio de microarranjo mostrou que HU induz a expressão de componentes celulares antioxidantes, tais como SOD2, GSR, GST1, GSTM2, MGST1, CR1, proteínas quinases fosfatidilinositol 3-fosfato C (PRKCB, PRKCZ, PIK3C2B) e p62/SQSTM1. Em contraste, foi observada a diminuição na expressão do fator transcricional BACH1. “Upstream analyses” demonstraram predição de ativação para o fator transcricional Jun e miR-155-5p.

CONCLUSÕES: a liberação excessiva de heme a partir de eventos hemolíticos recorrentes podem contribuir substancialmente para a gravidade da doença: (i) aumentando a auto-oxidação da HbS; (ii) aumentando o estresse oxidativo, inflamação sistêmica e dano tecidual; (iii) interferindo no metabolismo lipídico; (iv) e aumentando o risco de AVC. Hemácias íntegras e lisadas atuam como DAMPs induzindo diferentemente a expressão de componentes do inflamassoma e a produção de IL-1β e LTB4, contribuindo para o estabelecimento da inflamação. Além disso, a ativação do inflamassoma é mais pronunciada após estimulo com hemácias falciformes. O tratamento com HU não alterou a produção de citocinas pró-inflamatórias como a IL-1β, embora a diminuição na indução de NRLP3 do inflamassoma e secreção de LTB4 tenham sido demonstradas. Por fim, demonstrado que a HU pode atuar: (i) na inibição direta de EROs/ERNs; (ii) induzindo a produção de nitrito/nitrato na presença da hemina; (iii) estimulando a resposta celular antioxidante por indução do elemento de resposta antioxidante/eletrófilo (ARE/EpE) mediada pelo Nrf2 sob regulação de p62/SQSTM1. Em conjunto, esses achados podem auxiliar no desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas que possam ser utilizadas em conjunto com a indução de HbF visando minimizar a cronicidade inflamatória da doença.

Palavras-chave: anemia falciforme, hidroxiureia, estresse oxidativo, inflamassoma.

Imagem da Agência Fapesp

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