Autoria: Gabriele Louise Soares Martins
Orientação: Bruno Solano de Freitas Souza
Título da tese: “Estabelecimento de protocolos para diferenciação eritroide utilizando células-tronco pluripotentes induzidas obtidas de pacientes com anemia falciforme”.
Programa: Pós-Graduação em Biotecnologia em Saúde e Medicina Investigativa
Data de defesa: 03/12/2020
Horário: 09h
Local: Sala Virtual do Zoom | ID da reunião 943 1887 0999

RESUMO

INTRODUÇÃO: A anemia falciforme (AF) é uma doença genética de elevada prevalência no Brasil, principalmente na Bahia. O quadro clínico decorrente é de uma anemia hemolítica associada a eventos vaso-oclusivos e há poucas opções disponíveis para o tratamento farmacológico.As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) permitem o estudo de características celulares de pacientes acometidos por doenças genéticas, com maior profundidade e abrangência, como é o caso da AF. Através da diferenciação eritroide das iPSC obtidas de pacientes com AF, seria possível desenvolver um modelo in vitropara descoberta de novas alternativas terapêuticas.

OBJETIVO: Estabelecer um protocolo de diferenciação celular eritroide utilizando iPSCsde indivíduos com AF e doadores saudáveis.

MÉTODOS: Linhagens de iPSCs foram obtidas de três pacientes com AF e três controles saudáveis e genotipadas quanto ao haplótipo de HBB. As iPSCs foram submetidas ao protocolo de diferenciação eritroide em etapas: I. obtenção de progenitores hematopoiéticos (CPH); II. expansão de eritroblastos; e III. maturação terminal, etapas confirmadas por análise de citometria de fluxo para os marcadores CD34, CD45, CD71, CD36 e CD235a. Para confirmação da funcionalidade das CPH, foi realizado ensaio de célula formadora de colônia (CFC). Ao final, foi realizada análise morfologia por citocentrifugação seguida de coloração giemsa e análise de expressão de hemoglobina fetal e beta por RT-qPCR. RESULTADOS: Os haplótipos das iPSCs foram identificados como Benin/Benin e Benin/CAR. Através dos protocolos envolvendo formação de EB ou através de protocolo de diferenciação em 2D, foi possível obter CPH que expressam CD34+, CD45+e CD43+. No entanto, a utilização de meio APEL com placa de fundo em U não aderente foi capaz de gerar maior número de células, com percentuais satisfatórios. Utilizando este protocolo, foi alcançada uma expansão de 40x em relação ao número inicial de iPSC. Em ensaio de CFC, as CPHs foram capazes de formar colônias de diferentes tipos: BFU-E,CFU-E, CFU-GM e CFU-GEMM. Após a etapa II, as células apresentaram marcação CD36+/CD71+e produção de hemoglobina. A análise dos genes HBG2 e HBB (HbB) por RT-qPCR demonstrou a produção de HBG2 aumentada nas células derivadas de iPSC quando comparadas a uma amostra obtida de sangue periférico (SP), no entanto, o contrário foi observado para o gene HBB, caracterizando um perfil imaturo nas células eritroides geradas. Foi possível ainda observar marcação de 52% de células CD71+/CD235a+, e a presença de proeritroblastos, eritroblastos ortocromáticos e reticulócitos.

CONCLUSÕES:A realização de diferentes metodologias permitiu o estabelecimento do melhor protocolo de diferenciação para obtenção de células eritroides a partir de iPSC de pacientes com AF. Foram geradas CPHscom capacidade de diferenciação em diferentes colônias hematopoiéticas. Ajustes complementares na etapa de maturação, no entanto, são necessários para garantir a geração de células eritroides completamente maduras e expressando hemoglobina beta.

Palavras-Chave: Anemia falciforme; eritropoiese; iPSCs

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