AUTORIA: Flávio Henrique de Jesus Santos
ORIENTAÇÃO: Leonardo Paiva Farias
TÍTULO DA DISSERTAÇÃO: “Obtenção e caracterização de leishmania infantum deficiente para o gene Ipg2”.
PROGRAMA: Pós-Graduação em Patologia Humana (UFBA /FIOCRUZ)
DATA DE DEFESA: 03/07/2019

RESUMO

INTRODUÇÃO: O glicoconjugado LPG é uma das moléculas dominantes na superfície do estágio de promastigota de Leishmania. Este fator de virulência multifuncional participa em uma variedade de processos durante o estabelecimento da infecção no hospedeiro mamífero. Além do LPG, esses protozoários possuem em sua superfície outras moléculas como os PPGs, PGs e sAP que contribuem para a sobrevivência da Leishmania dentro da célula hospedeira, Umas das enzimas essenciais para síntese do LPG e destas outras moléculas contendo fosfoglicanos (PGs) em sua estrutura é a GDP-manose transferase que é codificada pelo gene lpg2.

OBJETIVO: Caracterizar a estrutura do gene lpg2 no genoma de L. infantum (MCAN/BR/89/BA262). Obter parasitas lpg2-/- e caracteriza-los molecularmente e avaliar sua virulência em ensaios de infecção de macrofágos in vitro.

MÉTODOS: A edição do genoma foi realizada utilizadando o método clássico de recombinação homóloga com marcadores de resistência a antibióticos, e posteriormente com o sistema CRISPR/Cas9. Os parasitas nocautes foram selecionados utilizando ensaios de aglutinação com anticorpo CA7AE e com a lectina (RCA 120).

RESULTADOS: O processo de obtenção dos parasitas nocautes pro recombinação homóloga se demonstrou inviável devido a presença de uma cópia adicional do gene lpg2 no genoma de L. infantum que não havia sido descrita anteriormente. Esse resultado nos levou a utilizar o sistema CRISPR/Cas9 para a interrupção do gene lpg2 nesta espécie. Cinco clones foram isolados após as etapas de seleção utilizando o anticorpo CA7AE e posteriormente a lectina (RCA 120). Os resultados obtidos com o sequenciamento mostraram a ocorrência da edição esperada no genoma em todos os clones. Além disso, o resultado do Western blot mostrou a perda completa da expressão do LPG e de PGs. Os resultados de curvas de crescimento mostram que todos os clones lpg2-/- apresentam um fenótipo (morfologia) e uma taxa de crescimento similar, sugerindo a ausência de efeitos de edição inespecíficos “offtargets”. Ensaios preliminares de infecção de macrófagos murinos in vitro utilizando os parasitas lpg2-/-, demonstram uma redução na taxa de infecção (4h – 34,5% e 72h – 34,6%) além de uma diminuição na carga parasitária (4h – 46,17% e 72h – 49,88%)..

CONCLUSÃO: Os resultados obtidos demonstra que conseguimos implementar com sucesso o sistema CRISPR/Cas9 no laboratório e os dados dos ensaios de infecção reforçam a importância do LPG e outros PGs como fatores de virulência na interação parasito-hospedeiro.

Palavras-chave: CRISPR/Cas9, L. infantum, lipofosfoglicano, LPG2.

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