AUTORA: OLIVEIRA, Barbara Maria Nascimento de.
ORIENTADOR: OLIVEIRA, Geraldo Gileno de Sá.
TÍTULO DA DISSERTAÇÃO: Produção IL-7 canina no sistema baculovírus-células de inseto.
PROGRAMA: Mestrado em Biotecnologia em Saúde e Medicina Investigativa – Instituto Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz.
DATA DE DEFESA: 21/03/2016
RESUMO
INTRODUÇÃO: A interleucina 7 (IL-7) é uma citocina pleiotrópica produzida principalmente por células estromais da medula óssea, células epiteliais tímicas e intestinais. IL-7 e que promove o desenvolvimento de linfócitos T e B e diferenciação de células T memória, especialmente CD4+. Por isso, diversos autores têm estudado a capacidade de IL-7 promover a restauração da população de linfócitos em situações de linfopenia e resposta imune de memória. Cães que desenvolvem leishmaniose visceral e recebem tratamento específico apresentam cura clínica. No entanto, após a interrupção do tratamento, a maioria dos animais exibe recaída da doença, mesmo na ausência de reinfecção. É possível que esse fenômeno esteja associado a uma dificuldade de estabelecimento de linfócitos T de memória específicos para Leishmania em cães. Em nosso laboratório, tentativas prévias foram realizadas para produzir a IL-7 canina em Escherichia coli, no entanto, o rendimento da proteína biologicamente ativa foi pequeno.
OBJETIVO: Por isso, resolveu-se avaliar a viabilidade de produzir IL-7 do sistema baculovírus-células de inseto.
MATERIAL E MÉTODOS: No presente trabalho, uma construção de DNA foi concebida contendo uma sequência de nucleotídeos que codificam o peptídeo sinal da proteína GP64 do baculovírus da Autographa californica (AcMNPV), a IL-7 canina (proteína madura) com códons otimizados para a tradução em Trichoplusia ni, um espaçador com 23 aminoácidos e uma cauda de seis histidinas. A construção de DNA elaborada foi sintetizada quimicamente, inserida em um plasmídeo de clonagem (pUC57-GP64caIL-7), subclonada em um plasmídeo carregador (pFastBac1- GP64caIL-7), adequado para o sistema baculovirus-célula de inseto, e transferida para o cromossoma artificial do baculovírus recombinante (bacmídeo).
RESULTADOS: A produção de IL-7 recombinante canina (rcaIL-7) em células de inseto infectadas com baculovírus recombinante foi otimizada. Em seguida, a rcaIL-7 foi produzida em células High-five cultivadas em suspensão utilizando multiplicidade de infecção (MOI) de 5 e tempo de infecção (TOI) de 48 h. A proteína recombinante foi purificada por cromatografia de afinidade em Sepharose-níquel, obtendo-se um rendimento médio de 5,5 mg por litro de cultivo.
CONCLUSÃO: RcaIL-7 purificada, avaliada a 40 ng/mL, mostrou-se capaz de promover a proliferação de células mononucleares de sangue periférico de cães sadios, sem estímulo prévio ou concomitante, indicando que a proteína foi produzida biologicamente ativa. Futuros estudos serão realizados para avaliar a capacidade imunomoduladora da rcaIL-7 em cães e determinar a utilidade dessa citocinas no tratamento de enfermidades caninas, como por exemplo, na leishmaniose visceral canina.
Palavras-chave: Interleucina 7; células mononucleares; cão.
